1、差别的细胞，喜好的情况是纷歧样的。

这个不但仅是说培育基的差别，另有便是细胞生长的空间密度题目。

有一些细胞是数目多一点比力好生长，生长形态也比力好。这种一样平常是属于生长速率慢的细胞。譬如内皮细胞。而有一些是细胞是数目少一点细胞形态会生长的比力好，譬如巨噬细胞和某些肿瘤细胞。尤其是巨噬细胞，生长速率十分得快，贴壁速率很快，以是传代时就应该留很大批的细胞，如许细胞形态会比力好。而且巨噬细胞比力喜好扎堆生长，而堆与堆之间是有空间的。假如长成相连在一同的一满片的时分，细胞形状根本上就会差了，老化的会比力多，对前期实行后果是欠好的。以是在养细胞的时分应该探索该细胞喜好的生漫空间密度题目。

2、关于有些人总是会遇到养的细胞形状怎样都欠好的题目。

这个实在是有一个办法可以改进的。关于贴壁细胞，假如细胞形状欠好，（大概细胞形状不明晰，外表似有异物等）可以在传代的时分举行如下操纵：

起首，倒失旧的培育基，参加3ml新的培育基（有无血清的都可）洗濯一次，用滴管吸走，然后再参加3ml的培育基，举行预奏乐，控制奏乐力度，悄悄地大约沿着瓶底过一遍，然后吸走。这时侯再开端正式的消化、奏乐。（巨噬细胞ag九游会只奏乐，不用化的）

其次，把奏乐上去的细胞悬液参加到新的培育瓶内，培育瓶事前参加培育基，放入培育箱内培育，定时间点察看细胞贴壁状况。10分钟察看一次，20分钟，30分钟察看一次。选择一个工夫点，曾经有局部细胞贴壁的状况下，重新置于干净台，底面朝上敏捷倒出此中的培育基，参加3ml新培育基再悄悄洗一次。然后参加完全培育基培育。后续察看细胞生长状况以及形状。我称之为“二传”。呵呵。

假如一次结果还不睬想，可反复屡次。直到找到细胞完善形状。此中要留意，联合细胞喜好的生长状况。喜好多一点数目长得好的细胞你就等贴壁细胞比力多点的时分再传。反之亦然。这个是我师兄创造的，谢谢他了。这个办法真的很好用！

3、关于培育瓶内参加培育基的量的题目。

这个是要靠本人去探索你所养的细胞的。并不是小的玻璃方瓶12ml，小气瓶14ml的。有些细胞反而是培育基少一点相反细胞形状会长得比力好。（大概也是竞争很大，有优越劣汰吧。呵呵。）关于生长速率快的细胞，易生长的细胞加少一点培育基细胞形状会更好。但要留意换液掌握。

4、关于选择培育瓶的题目。

团体发明生长速率快的细胞在玻璃瓶内生长的形态会比一次性塑料瓶绝对好一些。而关于统一种细胞，在其生长茂盛疾速的时期在玻璃瓶内的生长形态也比塑料瓶内好。这大概是由于塑料瓶比玻璃瓶更容易贴壁。生长速率快的细胞在塑料瓶这种绝对“更清闲”的情况里反而长得形态不如玻璃瓶好。

以是关于生长速率慢的细胞假如想要更美丽的细胞形态，塑料瓶比玻璃瓶会好，关于生长速率慢的细胞，玻璃瓶则会更好。异样，关于统一种细胞，在其生长速率慢的时分，塑料瓶会好一点，好比方才苏醒的时分，大概原代培育的时分。而在其生长茂盛的时分，玻璃瓶则绝对会好一点。

2010-7-23更新：

5、传代时消化的题目。

可以如许说，关于必要消化传代的细胞，每一次的消化都是对这个细胞存活与否，形态好与欠好最至关紧张的磨练。

许多同砚都遇到过这个题目，本人养的细胞开端的几代长的还挺好的，但是穿过几代之后就发明本人的细胞不可了，形态越来越低劣了。关于这个题目，可以十分一定地说，你的消化关键出题目了。你每一次的消化都让细胞遭到较大毁伤了。以是，越长越差。

在消化的历程中，你参加胰酶后，一切细胞都在被胰酶消化着，但ag九游会无视了一个题目便是，细胞的生长形态是纷歧样的，每一个细胞的贴壁状况也是纷歧样的，有的贴壁结实，有的贴壁没有那么结实的，以是，让一切的细胞消化异样的工夫对细胞是不公正的，他们遭到了差异报酬固然会有性情啊。。。呵呵。我厥后抵消化的办法举行了改进。夺取做到因材施教呵呵。我称之为“四步消化法”。（以难消化细胞为例）

详细操纵：

1）起首不加胰酶，倒失旧培育基参加大批新培育基洗1-2遍，（这是前奏，即为第一步，目标是将漂泊着的去世细胞之类只管即便洗失。

2）然后再参加大批新培育基间接奏乐一遍，这一遍是把贴壁不结实的细胞奏乐上去。再用培育基洗一遍，两次所得悬液混淆传入新瓶。即为第二步（你可以将这些传入新瓶培育，以与前面胰酶消化过的细胞比拟察看看谁长的更好一点就晓得该细胞对胰酶的敏感度了。）

3）吸洁净瓶内剩余液体，参加0.3ml左右的胰酶润洗一遍，吸失弃之，再参加1ml左右的胰酶消化。消化的同时置于显微镜下察看，待细胞与细胞之间间隙分明的时分立刻吸失胰酶与洁净子弹头里备用，参加新培育基开端奏乐，奏乐2-3遍后汲取悬液于试管或新瓶暂存。用2ml左右新培育基洗一遍与后面的混淆。（你也可以传入新瓶培育，以与前面及后面的做比拟。）这是第三步。

4）然后把后面刚吸出来的胰酶重新加出来瓶里持续消化剩余的贴壁结实的细胞。固然你也可以用新的胰酶，假如你们那比力富饶的话，呵呵。持续镜下察看，待剩余细胞间隙分明，细胞独立开来的时分，吸失胰酶，参加新培育基奏乐。悬液传入新瓶培育（依据实践状况你本人掌握）。这是第四步。

实在还可以有第五步，关于分外难消化的细胞和对胰酶分外敏感的细胞的话，你可以持续加第五步乃至第六步。为了细胞更好的形态，更美丽的样子，没措施，你必需分多批屡次消化，如许才干最大限制地将胰酶对细胞的毁伤降到最低，包管细胞的形态可以最优。

固然了，假如细胞是属于那种很容易消化的细胞，像RAW264.7，仅仅第二步就搞定了。就没须要第三步第四步了。这个是必要你在实行中可以本人埋头去领会的。发起你承受一个新细胞时把各步消化的细胞辨别培育起来做比力，去探索好细胞对胰酶的要求。便于你后续实行的展开。

将细胞消化分红这几步，除了是为了制止胰酶对细胞的毁伤之外，另有一个更紧张的作用便是，可以最大水平地把细胞奏乐成单个单个的形态，不可片不连体。

由于细胞生长的时分一定是要互相联系，大局部的细胞都是要成片生长的，尤其是关于贴壁细胞，单个细胞贴壁之后长着长着就长到一片去了。但假如是成片的细胞抱团的话，传代后细胞是不克不及贴壁的，如许抱团的细胞就会殒命。以是，消化传代的时分肯定要将细胞消化成单个单个的独立形态，这个啊黑白常讲求你的工夫的！

细胞一旦零落入悬液里你很难再将他奏乐成单个，由于他没有受力点了。很难找到受力点让你对他奏乐的力疏散开细胞。以是必需要在细胞未零落之前将其奏乐开，受力点便是细胞贴壁的地方。如许你就必需要严厉控制好消化的水平啊，这和大家做饭掌握好火候是一样的原理啊。既要消化到容易奏乐上去，又不克不及太甚，一吹就整片零落，要单个单个地往下失。以是我才要分批分次地加胰酶消化便是为了包管差别生长形态贴壁水平的细胞可以都维持在好的受力点疏散开。这个是很紧张的一点。尤其是关于某些细胞这一点便是他活去去世的致命点。像Caco-2细胞便是云云。

别的关于传代很紧张一点便是肯定不克不及比及细胞长满的时分才去消化传代。要在细胞长到70%左右的时分就要传代了，一旦发明细胞生长中曾经有叠层生长的时分就要立刻举行消化传代。不克不及再拖了。

6、关于换液传代时分洗瓶的题目。

这个发明吧没有颠末大范围验证呵呵。

关于用DMEM培育基培育的细胞，你在洗的时分假如是用无血清1640去洗细胞在随即后的频频中会比用DMEM洗的长的要好。异样，用1640培育的也有这个征象。按这原理说，都用PBS去洗的话结果应该更好一点的，但用PBS并没有呈现预期的结果，只是复杂呈现在几种长的很壮的细胞内里。这个我也没有确切的缘故原由说法，估量是PBS的这个条件差异照旧大了一点，对细胞的短时安慰绝对较大了。绝对来说培育液照旧更平和一点。有点甜而不腻的那种觉得吧。